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    elisa試劑盒”常見的問題及解答
    更新時間:2024-02-01瀏覽:475次

      “elisa試劑盒"常見的問題及解答


      問:抗原檢測出的分子量比資料上的大,是怎么回事?

      答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時間延長,可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等。

      問:蛋白轉移不到膜上,但膠上有,同時Marker 轉上去了,為什么?

      答:可能是:a)樣品濃度過低;b)轉移時間不夠。

      問:磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等?

      答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般加。但是不加也可以,大部分時候是不用加的。

      問:要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在,需要做免疫組化和western blot試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?

      答:①免疫組化可以用來進行定位,但是不能定量,而且有時會有假陽性,不易與背景區分;Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子,進行定量,但是不能定位。

     ?、趦煞N實驗的一抗有時候不能通用,公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗,在免疫組化時,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

      問:做Western Blot時,提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現在越來越差,上樣量已加到120μg,換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

      答:懷疑是樣品問題,可能是:1,樣品不能反復凍融;2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,建議檢查Western Blot過程,提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說,一般加PMSF就可以了,能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

      問:細胞水平要做western blot,多少細胞提的蛋白夠做western blot?

      答:一般5×10^6就足夠了

      問:同一樣品能同時提RNA又提蛋白么?這樣對western blot有無影響?

      答:能,沒有問題。

      問:同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?

      答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。

      問:如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?

      答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

      問:我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上,就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?

      答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉移時你可以用減少電流延長時間,加20%甲醇。

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